Dithiothreitol (DTT) là chất khử được sử dụng phổ biến, còn được gọi là chất phụ gia xanh mới.Nó là một hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ có hai nhóm mercaptan (-SH).Do đặc tính khử và tính ổn định của nó, DTT được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân tử.
Vai trò chính của DTT là làm giảm liên kết disulfide trong protein và các phân tử sinh học khác.Liên kết disulfide là một phần quan trọng của quá trình gấp và ổn định protein, nhưng trong một số điều kiện thí nghiệm nhất định, chẳng hạn như phân tích SDS-PAGE có thể khử, tái tổ hợp và gấp protein, cần phải giảm liên kết disulfide thành hai nhóm thiol để làm sáng tỏ cấu trúc không gian của chất đạm.DTT có thể phản ứng với các liên kết disulfide để khử chúng thành các nhóm mercaptan, do đó mở ra cấu trúc không gian của protein và giúp dễ dàng phân tích và thao tác.
DTT cũng có thể được sử dụng để bảo vệ hoạt động và sự ổn định của enzyme.Trong một số phản ứng được xúc tác bởi enzyme, hoạt tính của enzyme có thể bị giảm bởi chất oxy hóa.DTT có thể phản ứng với các chất oxy hóa để khử chúng thành các chất vô hại, từ đó bảo vệ hoạt động và sự ổn định của enzyme.
So với các chất khử truyền thống như β-mercaptoetanol (β-ME), DTT được coi là chất khử an toàn và ổn định hơn.Nó không chỉ ổn định trong dung dịch nước mà còn duy trì tính chất khử trong điều kiện nhiệt độ cao và axit-bazơ.
Việc sử dụng DTT tương đối đơn giản.Nói chung, DTT được hòa tan trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó được thêm vào hệ thống thí nghiệm.Nồng độ DTT tối ưu cần được xác định theo thí nghiệm cụ thể và thường được sử dụng trong khoảng 0,1-1mM.Nồng độ thấp hơn có thể làm giảm tác động bất lợi lên sự phát triển của tế bào và có thể làm giảm độc tính tế bào do sự biểu hiện quá mức của protein mục tiêu.Nồng độ cao hơn có thể gây ra gánh nặng trao đổi chất tế bào quá mức, ảnh hưởng đến sự phát triển và hiệu quả biểu hiện của tế bào.
Cách để xác định nồng độ tối ưu có thể là đánh giá mức độ biểu hiện của protein mục tiêu bằng cách tiến hành các thử nghiệm cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau.Các xét nghiệm nuôi cấy quy mô nhỏ có thể được thực hiện bằng cách sử dụng nhiều nồng độ IPTG (ví dụ 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, v.v.) và có thể đánh giá hiệu quả biểu hiện ở các nồng độ khác nhau bằng cách phát hiện mức độ biểu hiện của protein mục tiêu (ví dụ: Western phát hiện vết mờ hoặc huỳnh quang).Theo kết quả thực nghiệm, nồng độ có hiệu quả biểu hiện tốt nhất được chọn là nồng độ tối ưu.
Ngoài ra, bạn cũng có thể tham khảo tài liệu liên quan hoặc kinh nghiệm của các phòng thí nghiệm khác để hiểu phạm vi nồng độ IPTG thường được sử dụng trong các điều kiện thí nghiệm tương tự, sau đó tối ưu hóa và điều chỉnh theo nhu cầu thí nghiệm.
Điều quan trọng cần lưu ý là nồng độ tối ưu có thể thay đổi tùy thuộc vào các hệ thống biểu hiện, protein mục tiêu và điều kiện thí nghiệm khác nhau, vì vậy tốt nhất nên tối ưu hóa theo từng trường hợp cụ thể.
Tóm lại, DTT là chất khử thường được sử dụng, có thể được sử dụng để giảm liên kết disulfide trong protein và các phân tử sinh học khác, đồng thời để bảo vệ hoạt động và sự ổn định của enzyme.Nó đã được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm sinh hóa và sinh học phân tử.
Thời gian đăng: 28-09-2023