IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) là một chất tương tự của chất nền β-galactosidase, có tính cảm ứng cao.Dưới sự cảm ứng của IPTG, chất cảm ứng có thể tạo thành phức hợp với protein ức chế, do đó cấu trúc của protein ức chế bị thay đổi, khiến nó không thể kết hợp với gen mục tiêu và gen mục tiêu được biểu hiện một cách hiệu quả.Vậy nồng độ IPTG nên được xác định như thế nào trong quá trình thí nghiệm?Càng lớn càng tốt?
Trước tiên, hãy tìm hiểu nguyên lý cảm ứng IPTG: Operon (nguyên tố) lactose của E. coli chứa ba gen cấu trúc Z, Y và A mã hóa lần lượt là β-galactosidase, permease và acetyltransferase.lacZ thủy phân lactose thành glucose và galactose, hoặc thành allo-lactose;lacY cho phép lactose trong môi trường đi qua màng tế bào và đi vào tế bào;lacA chuyển nhóm acetyl từ acetyl-CoA sang β-galactoside, giúp loại bỏ tác dụng Độc.Ngoài ra còn có trình tự vận hành O, trình tự khởi đầu P và gen điều hòa I. Mã gen I là protein ức chế có khả năng liên kết với vị trí O của trình tự vận hành, do đó operon (meta) bị ức chế và đã tắt.Ngoài ra còn có một vị trí liên kết cho vị trí liên kết protein-CAP của chất hoạt hóa gen dị hóa ngược dòng của trình tự khởi đầu P. Trình tự P, trình tự O và vị trí liên kết CAP cùng nhau tạo thành vùng điều hòa của operon lac.Các gen mã hóa của ba enzyme được điều hòa bởi cùng một vùng điều hòa để đạt được sự biểu hiện phối hợp của các sản phẩm gen.
Khi không có lactose, operon lac (meta) ở trạng thái bị ức chế.Tại thời điểm này, chất ức chế lac được biểu hiện bằng trình tự I dưới sự kiểm soát của trình tự khởi động PI liên kết với trình tự O, ngăn cản RNA polymerase liên kết với trình tự P và ức chế quá trình bắt đầu phiên mã;khi có mặt lactose, operon lac (meta) có thể được tạo ra. Trong hệ thống operon (meta) này, chất cảm ứng thực sự không phải là lactose.Lactose đi vào tế bào và được xúc tác bởi β-galactosidase để chuyển thành allolactose.Loại thứ hai, với tư cách là một phân tử cảm ứng, liên kết với protein ức chế và thay đổi cấu trúc protein, dẫn đến sự phân ly protein ức chế khỏi trình tự O và phiên mã.Isopropylthiogalactoside (IPTG) có tác dụng tương tự như allolactose.Nó là một chất cảm ứng rất mạnh, không bị vi khuẩn chuyển hóa và rất ổn định nên được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm.
Làm thế nào để xác định nồng độ tối ưu của IPTG?Lấy E. coli làm ví dụ.
Chủng biến đổi gen E. coli BL21 chứa pGEX tái tổ hợp dương tính (CGRP/msCT) được cấy vào môi trường lỏng LB chứa 50μg·mL-1 Amp và nuôi cấy qua đêm ở 37°C.Dịch cấy trên được cấy vào 10 chai môi trường lỏng LB tươi 50mL chứa 50μg·mL-1 Amp với tỷ lệ 1:100 đối với nuôi cấy mở rộng và khi giá trị OD600 là 0,6~0,8, IPTG được thêm vào nồng độ cuối cùng.Đó là 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1.Sau khi cảm ứng ở cùng nhiệt độ và cùng thời gian, 1 mL dung dịch vi khuẩn được lấy từ đó và các tế bào vi khuẩn được thu thập bằng cách ly tâm và sử dụng SDS-PAGE để phân tích ảnh hưởng của nồng độ IPTG khác nhau đến biểu hiện protein, sau đó chọn nồng độ IPTG có biểu hiện protein lớn nhất.
Sau khi thử nghiệm, người ta thấy rằng nồng độ IPTG không lớn nhất có thể.Điều này là do IPTG có độc tính nhất định đối với vi khuẩn.Vượt quá nồng độ cũng sẽ giết chết tế bào;và nói chung, chúng tôi hy vọng rằng càng nhiều protein hòa tan được biểu hiện trong tế bào thì càng tốt, nhưng trong nhiều trường hợp khi nồng độ IPTG quá cao, một lượng lớn tạp chất sẽ được hình thành.Cơ thể nhưng lượng protein hòa tan lại giảm.Vì vậy, nồng độ IPTG phù hợp nhất thường không phải càng lớn càng tốt mà là nồng độ càng thấp.
Mục đích của việc tạo giống và nuôi cấy các chủng biến đổi gen là nhằm tăng năng suất protein mục tiêu và giảm chi phí.Sự biểu hiện của gen mục tiêu không chỉ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố riêng của chủng và plasmid biểu hiện mà còn bởi các điều kiện bên ngoài khác, chẳng hạn như nồng độ của chất cảm ứng, nhiệt độ cảm ứng và thời gian cảm ứng.Vì vậy, nhìn chung, trước khi biểu hiện và tinh chế một loại protein chưa biết, tốt nhất nên nghiên cứu thời gian cảm ứng, nhiệt độ và nồng độ IPTG để lựa chọn điều kiện thích hợp và thu được kết quả thí nghiệm tốt nhất.
Thời gian đăng: 31/12/2021