IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) là một chất tương tự của chất nền β-galactosidase, có khả năng cảm ứng cao. Dưới tác động của IPTG, chất cảm ứng có thể tạo phức hợp với protein ức chế, làm thay đổi cấu trúc của protein ức chế, khiến nó không thể kết hợp với gen đích, và gen đích được biểu hiện hiệu quả. Vậy nồng độ IPTG cần được xác định như thế nào trong thí nghiệm? Nồng độ càng cao càng tốt?
Trước tiên, hãy cùng hiểu nguyên lý cảm ứng IPTG: Operon lactose của E. coli chứa ba gen cấu trúc, Z, Y và A, mã hóa lần lượt cho β-galactosidase, permease và acetyltransferase. lacZ thủy phân lactose thành glucose và galactose, hoặc thành allo-lactose; lacY cho phép lactose trong môi trường đi qua màng tế bào và vào bên trong tế bào; lacA chuyển nhóm acetyl từ acetyl-CoA sang β-galactoside, giúp loại bỏ tác dụng độc hại. Ngoài ra, còn có trình tự vận hành O, trình tự khởi đầu P và gen điều hòa I. Gen I mã hóa một protein ức chế có thể liên kết với vị trí O của trình tự vận hành, do đó operon (meta) bị ức chế và tắt. Ngoài ra, còn có một vị trí liên kết cho protein kích hoạt gen dị hóa - vị trí liên kết CAP nằm ở phía thượng nguồn của trình tự khởi đầu P. Trình tự P, trình tự O và vị trí liên kết CAP cùng nhau tạo thành vùng điều hòa của operon lac. Các gen mã hóa của ba enzyme được điều hòa bởi cùng một vùng điều hòa để đạt được sự biểu hiện phối hợp của các sản phẩm gen.
Khi không có lactose, operon lac (meta) ở trạng thái bị ức chế. Lúc này, protein ức chế lac được biểu hiện bởi trình tự I dưới sự kiểm soát của trình tự promoter PI liên kết với trình tự O, ngăn cản RNA polymerase liên kết với trình tự P và ức chế sự khởi đầu phiên mã; khi có lactose, operon lac (meta) có thể được cảm ứng. Trong hệ thống operon (meta) này, chất cảm ứng thực sự không phải là lactose. Lactose đi vào tế bào và được xúc tác bởi β-galactosidase để chuyển hóa thành allolactose. Chất sau, với vai trò là phân tử cảm ứng, liên kết với protein ức chế và làm thay đổi cấu trúc protein, dẫn đến sự phân ly của protein ức chế khỏi trình tự O và quá trình phiên mã. Isopropylthiogalactoside (IPTG) có tác dụng tương tự như allolactose. Nó là một chất cảm ứng rất mạnh, không bị vi khuẩn chuyển hóa và rất ổn định, vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm.
Làm thế nào để xác định nồng độ IPTG tối ưu? Lấy vi khuẩn E. coli làm ví dụ.
Chủng E. coli BL21 biến đổi gen chứa plasmid tái tổ hợp dương pGEX (CGRP/msCT) được cấy vào môi trường lỏng LB chứa 50μg·mL-1 Amp và nuôi cấy qua đêm ở 37°C. Mẫu nuôi cấy trên được cấy vào 10 chai 50mL môi trường lỏng LB tươi chứa 50μg·mL-1 Amp với tỷ lệ 1:100 để nuôi cấy mở rộng, và khi giá trị OD600 đạt 0,6~0,8, IPTG được thêm vào đến nồng độ cuối cùng là 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Sau khi cảm ứng ở cùng nhiệt độ và thời gian, lấy 1 mL dung dịch vi khuẩn, thu thập tế bào vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm và tiến hành điện di SDS-PAGE để phân tích ảnh hưởng của các nồng độ IPTG khác nhau đến biểu hiện protein, sau đó chọn nồng độ IPTG cho biểu hiện protein cao nhất.
Sau các thí nghiệm, người ta sẽ thấy rằng nồng độ IPTG không nên càng cao càng tốt. Điều này là do IPTG có độc tính nhất định đối với vi khuẩn. Vượt quá nồng độ này cũng sẽ giết chết tế bào; và nói chung, chúng ta mong muốn lượng protein hòa tan được biểu hiện trong tế bào càng nhiều càng tốt, nhưng trong nhiều trường hợp khi nồng độ IPTG quá cao, một lượng lớn thể vùi sẽ được hình thành, nhưng lượng protein hòa tan lại giảm đi. Do đó, nồng độ IPTG thích hợp nhất thường không phải là càng cao càng tốt, mà là nồng độ càng thấp càng tốt.
Mục đích của việc cảm ứng và nuôi cấy các chủng vi sinh vật biến đổi gen là để tăng năng suất protein mục tiêu và giảm chi phí. Sự biểu hiện của gen mục tiêu không chỉ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố nội tại của chủng và plasmid biểu hiện, mà còn bởi các điều kiện bên ngoài khác, chẳng hạn như nồng độ chất cảm ứng, nhiệt độ cảm ứng và thời gian cảm ứng. Do đó, nhìn chung, trước khi biểu hiện và tinh chế một protein chưa biết, tốt nhất nên nghiên cứu thời gian cảm ứng, nhiệt độ và nồng độ IPTG để lựa chọn các điều kiện thích hợp và thu được kết quả thí nghiệm tốt nhất.
Thời gian đăng bài: 31/12/2021